负染色首先由Hall在1955年提出。Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

对于负染色的机制目前还不十分了解。对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。

用作负染色的负染色剂应具有:

较强的电子散射能力以产生足够的图像反差; 熔点高，在电子束的轰击下不会升华; 溶解度大，不易析出沉淀; 在电镜下不呈现出可观察到的结构; 分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处; 与样品不起化学反应等。 目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。

它们的配制方法如下:

磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1%~3%的溶液，使用时应用1 mol/L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4~7.0或实验所需的值。 醋酸铀:通常使用双蒸水配制成0.2%~0.5%水溶液(pH4.5)。醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。醋酸铀溶解需15~30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。 甲酸铀:用双蒸水配制成0.5%~1%水溶液，pH值为3.5，使用时用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5~5.2。 钼酸铵:用双蒸水配制成2%~3%水溶液，使用时用醋酸铵将pH值调至7.0~7.4。钼酸铵对有界膜的生物材料具有特别良好的染色值。 [编辑]

悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作。如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1~2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1~2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。干燥时，由于表面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二醛或四氧化锇预固定。预固定在滴样之后进行。

喷雾法 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故此法不常用。

漂浮法 先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。

一个理想的负染样品的图像应是均匀的，在一万倍的放大倍率下，图像出现一些薄薄的染色斑块，其特点是没有明显的边缘，染色斑由中央向边缘由深到浅，有一个逐渐变化的过程，如同中国水墨画的润色一样。在3~4万倍观察时则可见到反差良好而柔和的生物结构。而与此相反，黑白截然分明，缺乏由浅到深的中间色调，或在明亮的载网上出现颗粒性团块，则是染色失败的表现。因此，虽然负染色方法简单，但要获得理想的负染色效果和实验的重复性却不大容易。下列因素在操作中需加以注意:

悬液样品的纯度 待染色的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不要有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯。

悬液样品的浓度 样品悬液的浓度要适中，否则太稀时在电镜下寻找样品将很困难;太浓时，样品的堆集会影响观察。因此第一次制样时，同时用几种浓度的样品进行滴样，从而采用浓度适中的铜网进行观察。一般负染色技术通常要求每份样品至少含有10^7/ml目标颗粒，才能被观察到。

样品和染色液的均匀分布问题 生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜。使用其它支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不容易拍摄到好的照片。但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集，在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节。为了提高染色效果，需要设法促进样品和染料的均匀分散，可采用以下方法:

{使用分散剂} 常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液。方法是把0.005%~0.05%牛血清蛋白溶液加到样品悬液内，所加量无严格的规定，先加数滴，如果仍不见效可适当增加;也可以直接用0.01%BSA作为离心沉淀物的稀释液。此外，也可以用杆菌肽，按30~50μg/ml的浓度用蒸馏水配制成溶液，用作沉淀物的稀释液。或将样品悬液，PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样。 {亲水性处理} 对碳膜进行亲水性处理方法如下:把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa~1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性。用这种碳膜就不存在样品与染色剂凝集的问题。但要注意碳膜经亲水性处理后，经过1~2天又会变为疏水性的，因此最好亲水性处理后立即使用。 样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响。为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2%醋酸铵或硫酸铵作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜。

染色液的酸碱度不仅影响到染色液的扩散，而且会对病毒的形态造成一定影响。负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果。某些负染色剂及其pH的参考值见表:

某些负染色剂及其pH参考表

不同的样品要求不同的pH值，因此，在具体应用时，不要生搬硬套，而应当做必要的摸索。

染色的时机

染色的时机十分重要。滴染色液的时机一般既不要在生物样品完全干了之后，更不应在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色。恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液。如果载网上尚有悬液残存时就进行染色，或者完全干后再染色，效果都不佳。

负染色引起的缺陷

负染色的应用，尤其有助于用电镜研究小的、游离的悬浮物，如病毒，细胞器，如叶绿体，线粒体等。负染色方法染色本身，染色液的溶剂、离子组成、亲水性、pH值和干燥情况的变化都可引起缺陷。一种比较常见的缺陷是表现为白色的小球(图ref{Fig-Negtive-Flaw})。在进行病毒形态鉴定观察分析时，这种小泡的存在很容易误导，尤其很容易被当作球状病毒。一般样品中的悬浮介质或染色液的pH值偏低时比较容易导致这种缺陷发生。

样品的亲水性，也很容易形成负染色缺陷。当样品亲水性差时，负染色结果经常显示背景差，且样品浓度等得不到真实的显示，引起误解。这时对样品吸附介质，如Fomvar膜进行亲水性的处理，如喷碳、离子蚀刻或采用新鲜制备的铜网等都会改善这种缺陷。

某些结构，如线粒体基粒、核糖体和蛋白质及其组装成的纤维甚至病毒等，可以通过负染色(negative staining)电镜技术观察其精细结构。其分辨率可达1.5nm左右。负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经过自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。